{"id":216,"date":"2006-06-16T20:08:04","date_gmt":"2006-06-16T18:08:04","guid":{"rendered":"http:\/\/www.manq.it\/wordpress\/?p=216"},"modified":"2010-12-14T12:43:03","modified_gmt":"2010-12-14T11:43:03","slug":"discorso-complesso","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/2006\/06\/16\/discorso-complesso\/","title":{"rendered":"Discorso complesso"},"content":{"rendered":"

E’ difficile spiegare il problema che mi attanaglia sul lavoro.
\nOggi ho ripetuto l’esperimento di Mercoled\u00ec scorso, per confermare il risultato. Ci\u00f2 che ne \u00e8 venuto fuori \u00e8 un dato che al contempo avvalora e smentisce quanto prodotto in settimana, lasciandomi con in testa un discreto caos.
\nVediamo se scrivere il tutto con calma, pazienza e a mente fredda mi aiuter\u00e0 a trovare il bandolo della matassa.
\nI frutti dell’esperimento in questione sono delle attivit\u00e0 luciferasiche X<\/span><\/strong>. Queste dipendono dai livelli di “Firefly” luciferasi prodotti da HeLa Cells trasfettate con costrutti plasmidici presentanti al loro interno la sequenza promotoriale in analisi. Questa \u00e8 deputata a regolare la produzione della proteina, alias appunto Firefly.
\nTanto pi\u00f9 grande \u00e8 il valore di X misurato, quanta pi\u00f9 proteina \u00e8 stata prodotta dalle cellule.
\nPerch\u00e8 il valore ottenuto sia significativo, occorre tuttavia un controllo dell’efficienza di trasfezione. Su pi\u00f9 misurazioni potrebbe infatti verificarsi una variazione di X non dovuta alla diversa attivit\u00e0 della sequenza promotoriale studiata, ma al fatto che le cellule che hanno internalizzato il costrutto e che quindi siano in grado di produrre la proteina (quelle che si definiscono trasfettate) siano in quantit\u00e0 differente. Per questo motivo nelle stesse cellule si trasfetta un secondo costrutto contenente “Renilla” luciferasi controllata da una sequenza promotoriale molto forte e di sicuro e costante funzionamento, quella virale di CMV . Sar\u00e0 possibile quindi misurare un’ulteriore attivit\u00e0 N<\/span><\/strong> dovuta alla seconda proteina trasfettata (Renilla) e indicativa dell’efficienza di trasfezione. Il rapporto X\/N<\/span><\/strong> consente di equiparare esperimenti dalle diverse efficienze, eliminando quindi dai dati elementi dovuti alla variabilit\u00e0 sperimentale.
\nNelle prove fatte fino ad ora il rapporto X\/N si \u00e8 riconfermato, evidenziando una certa validit\u00e0 nel dato. Questo \u00e8 molto positivo e, di conseguenza, non \u00e8 qui che sta il problema.
\nLo studio \u00e8 volto a misurare l’attivit\u00e0 della sequenza promotoriale quindi serve anche un termine di paragone e controllo negativo, rispetto al quale io possa esprimere quanto funziona la sequenza che sto studiando. Per fare questo dovr\u00f2 trasfettare le cellule anche con un costrutto in cui prima del gene per la Firefly non si trova alcuna sequenza promotoriale. Andando a misurare Y<\/span><\/strong>, ovvero l’attivit\u00e0 luciferasica di Firefly in queste cellule, potr\u00f2 quantificare il background che non \u00e8 altro che l’attivit\u00e0 non dovuta all’azione della mia sequenza in analisi, bens\u00ec intrinseca. Anche l’efficienza di questa seconda trasfezione va tuttavia testata perch\u00e8 sia attendibile, quindi anche in questo caso \u00e8 necessario calcolare un rapporto Y\/N’<\/span><\/strong> come fatto in precedenza, rendendo anche questi controlli paragonabili tra loro.
\nOttenuto questo valore, baster\u00e0 calcolare (X\/N)\/Y\/N’)<\/span><\/strong> per vedere di quante volte la mia sequenza innalza la produzione della proteina rispetto al controlo in cui questa non viene prodotta.
\nFacendo un esempio numerico:
\nX= 100000
\nN= 2000000
\nX\/N= 0,05
\nY= 1000
\nN’= 3000000
\nY\/N’= 0,00033
\n(X\/N)\/Y\/N’)= 151,52
\nQuesto sta a significare che la mia sequenza promotoriale innalza la sintesi della luciferasi di 152 volte circa.
\nIl problema consiste nel fatto che, come detto, le trasfezioni non vengono sempre nello stesso modo e una valutazione sensibile come la luminescenza amplifica le piccole differenze tra i diversi assay dovute alla manualit\u00e0 dell’operatore.
\nPerch\u00e8 tutti gli scrupoli volti a normalizzare che ho scritto fino ad ora non sono d’aiuto?
\nLa risposta \u00e8 semplice. Come spiegato, l’efficienza di trasfezione \u00e8 data da N e N’, numeri che di volta in volta possono variare anche di parecchio. Essendo per\u00f2 la variazione dovuta all’efficienza, dovrebbe variare proporzionalmente anche X poich\u00e8 se pi\u00f9 cellule hanno acquisito i costrutti esprimeranno una quantit\u00e0 maggiore di entrambe le luciferasi, mentre se ne avranno acquisito un minore quantitativo saranno entrambe le attivit\u00e0 a calare. Per quanto riguarda il rapporto X\/N non ci sono quindi problemi poich\u00e8, come ha senso che sia per quanto detto fino ad ora, questo si mantiene stabile. I problemi nascono invece rapportando Y ad N’ perch\u00e8 se anche aumenta l’efficacia della trasfezione e pi\u00f9 cellule accoglieranno i costrutti al loro interno, sar\u00e0 solo N’ a crescere, poich\u00e8 Y non dipende dall’efficienza essendo il valore dell’attivit\u00e0 di un costrutto privo di attivit\u00e0. Per questo motivo andando a calcolare (X\/N)\/Y\/N’) avr\u00f2 ogni volta valori diversi, come se la mia sequenza funzionasse in maniera differente.
\nQuesto \u00e8 il nocciolo della questione.
\nPi\u00f9 ci penso e pi\u00f9 penso che la soluzione del quesito sia banale, solo non mi viene in mente.
\nDevo riflettere.<\/p>\n

Foto del giorno n\u00b04 – Tower Bridge<\/strong>
\n\"Tower<\/a>
\n* Dedicata a Peich, Orifizio, Fex e Pio. Una settimana a Londra e non l’hanno visto. Babbi.<\/em><\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

E’ difficile spiegare il problema che mi attanaglia sul lavoro. Oggi ho ripetuto l’esperimento di Mercoled\u00ec scorso, per confermare il risultato. Ci\u00f2 che ne \u00e8 venuto fuori \u00e8 un dato che al contempo avvalora e smentisce quanto prodotto in settimana, lasciandomi con in testa un discreto caos. Vediamo se scrivere il tutto con calma, pazienza… Leggi tutto »Discorso complesso<\/span><\/a><\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"comment_status":"open","ping_status":"open","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"neve_meta_sidebar":"","neve_meta_container":"","neve_meta_enable_content_width":"","neve_meta_content_width":0,"neve_meta_title_alignment":"","neve_meta_author_avatar":"","neve_post_elements_order":"","neve_meta_disable_header":"","neve_meta_disable_footer":"","neve_meta_disable_title":"","footnotes":""},"categories":[14,11,4,46],"tags":[],"class_list":["post-216","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-fotografia","category-lavoro","category-riflessioni","category-scienza"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/216","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/comments?post=216"}],"version-history":[{"count":0,"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/posts\/216\/revisions"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=216"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=216"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.manq.it\/index.php\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=216"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}